2020年3月16日，上海交通大学瑞金医院赵维莅、陈赛娟以及黄金艳课题组合作取得了一项新成果，并于Cancer Cell（IF=26.602）上发表文章《Genomic and Transcriptomic Characterization of Natural Killer T Cell Lymphoma》。

这是首次对大量NKTCL样本进行多组学研究，并揭示其不同的分子亚型，包括 TSIM、MB和HEA亚型。这三种亚型在起源细胞、EBV基因表达、转录特征，以及对基于天冬酰胺酶的治疗方案和靶向治疗应答方面都不相同。该团队的研究提出了NKTCL逐步发病机制模型（图0），并且为NKTCL的临床治疗提供参考价值。

图0 NKTCL逐步发病机制模型

Affinity的三支抗体有幸参与到该研究中：

本文亮点

1 综合性分析对NKTCL分子分型提供参考

2 EBV裂解基因在NKTCL发病机制中起到重要作用

3 基于基因组突变的分子分型与临床结果有关联

4 MYC、组蛋白乙酰化和PD-L1/2是NKTCL潜在的治疗靶点

研究背景

1 NKTCL，是一种特异性的原发于结外组织的非霍奇金淋巴瘤，以CD56+/未分化CD3+淋巴瘤细胞的恶性增殖和高侵略性的临床学为特征。该病主要存在于亚洲和南美洲，与EBV感染有密切关系。但是，裂解基因在EBV相关癌症，特别是NKTCL中的作用从未被证实过。

2 如今，基于ASP的治疗方案使病人的治疗结果得到显著改善。DDX3X和TP53的突变被认为是CHOP治疗的NKTCL病人的不良预后指标。在基于ASP方案的最新治疗，与临床结果相关的分子分类需要被定义。

3 团队通过对全基因组测序（WGS）、全外显子测序（WES）、基于数组的拷贝数变化（CNV）分析和RNA测序（RNA-seq）结果进行多组学分析，从而对NKTCL中的人类基因突变和EBV特点有了一个宏图，并且根据生物学特征和临床结果发现不同的分子亚型。此外，还发现针对NKTCL每种分子亚型缺陷的提出潜在的治疗方案。

研究内容

1 基于起源细胞的遗传特征

SNV是最主要的突变类型，其在整个外显子中的累积通常与NKTCL的发病机制有关。该团队发现缺失突变和G/C>A/T变异的倾向明显（图1A），这可能是对编码蛋白的功能或结构的选择。

团队检测到58个已预测与癌症功能选择性相关的候选基因，包括SNVs、INDELs和CNVs，这些突变基因包括RNA解旋酶家族、肿瘤抑制因子、JAK-STAT通路分子、表观遗传修饰和RAS-MAPK通路分子。所有患者都含有上述五种突变，这证明了基因组突变在NKTCL致病机理中的作用。此外，该团队还对94名患者的CNV进行调查，如图1B。染色体6q21中的突变是最常见的突变，染色体片段反复突变和杂合性缺失（LOH）也被检测到。

图1 NKTCL中遗传变异和细胞的起源

TCR重排常被用来区分NK细胞和T细胞。该团队通过对102名患者进行RNA测序分析，起源的细胞通过基因表达模式被进一步确定。团队建立一种关于NK细胞和T细胞相关基因的定量基因表达指标，并且据此指标将病人分为NK细胞源（n=53）和T细胞源（n=49）（图1C）。

2 基因组突变相关的分子亚型

团队通过对RNA测序结果进行分类聚焦分析，将NKTCL的分子亚型分为3类，包括TSIM亚型、MB 亚型和HEA亚型，这些亚型与基因组突变有关。

从起源细胞和分子亚型关系来看，TMSI亚型病人的NK细胞表达水平显著高于MB和HEA亚型。HEA亚型病人的T细胞表达水平显著高于TMSI和MB亚型。不同突变在不同亚型中的趋势如图2。这些结果表明NKTCL的分子亚型与起源细胞有关。

图2 NKTCL中细胞的起源和分子亚型关系

3 NKTCL分子亚型的EBV模式

NKTCL肿瘤突变数为每兆位碱基对有3.3个突变，这与EBV相关的NPC和GC中突变数相当。这表明EBV在NKTCL疾病进展中的作用。团队收集了来自不同区域和不同疾病类型的126个EBV菌株的完整基因组，通过系统发育分析（图3A）和比较EBV序列覆盖面/SNVs，结果显示NKTCL中EBV序列存在高覆盖面和低SNVs的相似处。同时，这些数据为NKTCL在亚洲人群流行和鼻咽区域共同参与提供遗传学证据。EBV基因组中SNVs与疾病发病机制密切相关。

该团队发现，EBV转录本在三种亚型间有不同的模式。如图3B所示，MB亚型含有较低水平的潜在基因LMP1，HEA亚型表现为潜伏Ⅱ期和更高水平的裂解基因BNRF1，这是一种EBV感染潜伏期所必需的DAXX互作蛋白。TSIM亚型则是潜伏Ⅱ期和更高水平的BALF3裂解基因。为了进一步验证LMP1、BNRF1和 BALF3三种基因和细胞亚型之间的联系，团队对102名患者进行RT-PCR验证，如图3C。目前，BALF3基因的功能还不明确。该团队将基因组中不含EBV序列的BALF3野生株转染到NK-92细胞中，免疫荧光结果显示，BALF3的异位表达导致γH2AX和53BP1核水平的增加，这是DNA损伤的标志。但与载体对照相比，在LMP1和BNRF1基因过表达的细胞中没有这种现象（图3D）。与低水平基因组不稳定性相比，高水平和中水平基因组不稳定性的患者体内BALF3基因水平增高（图3E）。这些结果表明BALF3基因的过表达会导致DNA损伤，并且会导致NKTCL中的基因组不稳定性。

图3 NKTCL中EBV基因结构和表达

4 NKTCL分子亚型的临床意义

团队通过对基于ASP治疗方案的患者进行跟踪分析，发现三种分子亚型在无进展生存期和总生存数存在显著差异。MB亚型患者预后不良（图4A），Ⅰ期和Ⅱ期患者在PFS和OS无显著差异（图4B），MB亚型患者在Ⅲ期和Ⅳ期表现预后差（图4C）。当 IPI、PINK和PINK-E受控时，分子分类是影响PFS和OS的唯一预后因素，如图4D。

图4 NKTCL中分子亚型的临床结果

5 基于NKTCL分子亚型的靶向治疗

团队通过对RNA测序结果分析发现，3种分子亚型在致癌信号、免疫调制和细胞过程的基因表达标志不同，如图5A。图5B则揭示3种亚型参与的信号通路概况。TSIM主要参与致癌信号通路JAK-STAT 的激活、NK细胞免疫相关通路、抗原摄取和呈递以及PD-L1/2过表达和基因组不稳定性，MB亚型参与原癌基因MYC的过表达和多种致癌信号通路的上调，HEA亚型则是在组蛋白乙酰化时参与组蛋白伴侣DAXX和转录因子MEF2C的过表达。

图5 根据NKTCL的分子亚型的基因组特征和靶向药物

MGA突变和BRDT LOH是MB亚型的两个关键组成部分。MGA沉默，MGA表达显著降低（图6A左），MYC表达显著增加（图6A右），细胞集落形成增强（图6B），细胞侵袭增强（图6C）。EMT在MGA shRNA转染细胞中被激活，下调上皮标志物质 E-cadherin和上调间充质标志纤维连接蛋白和波形蛋白（图6D）。BRDT转录异位表达诱导MYC的表达(图6E和6F)和增强EMT(图6G)。这些都可以说明MGA突变和BRDT LOH可能参与肿瘤的传播，以及和不良的临床结果有关。

图6 MGA和BRDT的生物学功能

此外，团队还对RNA测序数据和用免疫组化法93例患者进行分析发现，PD-L1阳性表达在TSIM亚型中的发生率最高，MYC在MB亚型中最高，DAXX在HEA亚型中最高。这表明 PD-L1、MYC和DAXX可能是分子亚型的标志。

最后，该团队构建模拟三种分子亚型的临床前模型，以研究潜在的靶向治疗方案。TSIM模型中，NK-92细胞与外周血单个核细胞共培养，用PD-1 抗体pembrolizumab处理，TP53突变细胞诱导CD3+/CD8+ T细胞中Ki-67表达的显著增加，但NK-92细胞增长下降（图5C）。MB模型中，转染MGA shRNA的SNK-6和NK-92细胞对MYC抑制剂高三尖杉酯碱（HHT）的敏感性增强，斑马鱼体内模型也得到相同结果（图5D）。HEA模型中，SNK-6和NK-92细胞表达的EP300对组蛋白去乙酰化酶抑制剂奇酰胺更敏感，斑马鱼体内模型也得到相同结果（图5E）。

小结

本文阐述了NKTCL的三种亚型，揭示了三种亚型主要参与的致癌机制的分子网络。根据这三种亚型的特征，寻找出可能的靶向治疗方案。这些发现对于NKTCL的临床治疗提供非常重要参考价值。

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文献链接：

Xiong J et al. Genomic and Transcriptomic Characterization of Natural Killer T Cell Lymphoma. Cancer Cell 2020 Mar 16;37(3):403-419(PubMed: 32183952) [IF=26.602]